Geeniteraapiatoodete viirustest vabanemise valideerimise uuringuprotokollide kavandamise peamised kaalutlused

Geeniteraapia toodetel kui uue põlvkonna bioloogilistel ainetel on viiruse ohutuse hindamisel märkimisväärsed erinevused võrreldes traditsiooniliste rekombinantsete valgutoodetega. Geeniteraapia vektorid (nagu rekombinantsed adeno{1}}seotud viirused, AAV) on ise viirusliku päritoluga. Tootmise ajal seavad unikaalsed riskid, nagu abistajaviiruse saastumine ja replikatsiooni-kompetentsete viiruste (RCV) teke, erilised väljakutsed viiruse kliirensi valideerimisuuringute kavandamisel. Tuginedes autoriteetsetele regulatiivsetele juhistele, sealhulgas ICH Q5A(R2), NMPA, FDA ja EMA, vaadatakse selles artiklis süstemaatiliselt läbi geeniteraapiatoodete viiruse kliirensi valideerimise uuringuprotokollide peamised kavandamise kaalutlused, mis hõlmavad riskianalüüsi, indikaatorviiruse valikut, skaala-madala mudeli disaini, halvima-juhtumi seisundi analüüsi, inaktiveerimisprotsessi eriuuringuid ja statistilisi uuringuid. Eesmärk on pakkuda selle valdkonna praktikutele teaduslikult põhjendatud ja{10}}eeskirjadele vastavaid tehnilisi juhiseid.

I. Geeniteraapiatoodete viirusohutuse ainulaadsed aspektid

Viimastel aastatel on geeniteraapia valdkonnas tehtud märkimisväärseid edusamme. Alates 2025. aastast on mitmed geeniteraapiatooted saanud ülemaailmselt müügiloa, hõlmates selliseid ravivaldkondi nagu hemofiilia, võrkkesta düstroofia ja spinaalne lihasatroofia (SMA). Nende hulgas on rekombinantsed adeno-seotud viiruse (rAAV) vektorid kliinilistes rakendustes kõige laialdasemalt kasutatav geeniteraapia platvorm. Geeniteraapiatoodete viirusohutuse hindamine erineb aga põhimõtteliselt traditsiooniliste rekombinantsete valgutoodete omast.{5}}Geeniteraapia vektor ise on viirusliku päritoluga materjal, mis seab viiruse kliirensi valideerimisprotokollide kavandamisele täiesti uued nõuded.

Traditsioonilisi rekombinantseid valguprodukte (nt monoklonaalseid antikehi) toodetakse tavaliselt hästi iseloomustatud rakuliine, nagu CHO, kasutades, kus peamiseks viirusliku saastumise riskiks on endogeensed retroviirused, mis võivad olla rakupangas (nt näriliste retroviirusetaolised osakesed CHO rakkudes tootmise käigus), mis võivad juhuslikult sattuda viirustesse. Seevastu geeniteraapia tooted hõlmavad mitmesuguseid rakusubstraate, sealhulgas HEK293, HeLa ja CHO rakke. Veelgi kriitilisem on see, et toode ise on viirusvektor ja tootmise ajal esineb mitmeid riskitegureid: abistajaviiruse saastumine, replikatsiooni{9}kompetentsete vektorite (RCV/RCL) genereerimine ja vektori genoomi integreerimine peremeesgenoomi.

2023. aasta novembris võttis inimtervishoius kasutatavate ravimite tehniliste nõuete ühtlustamise rahvusvaheline nõukogu (ICH) ametlikult vastu Q5A(R2) suunise, millega viidi sisse suured uuendused viirusohutuse hindamises. Need värskendused hõlmavad äsja lisatud peatükki pideva tootmise kohta (7. peatükk), rangemaid nõudeid riskihindamise kohta ning spetsiifilisemaid kaalutlusi uudsete toodete ja tootmisprotsesside kohta. NMPA andis 2023. aastal välja rekombinantse adeno-seotud viiruse (rAAV) vektor-põhiste in vivo geeniteraapiatoodete farmatseutiliste uuringute ja kliiniliste uuringute rakenduste hindamise tehnilised juhised, millele järgnesid 2025. aastal rAAVoaVvektorite{1}Pharmaceutical Generation Generationas{1}B{7}} Ravitooted müügiloa taotluste jaoks, mis mõlemad sätestavad täpsemad tehnilised nõuded AAV geeniteraapia toodete viirusohutuse hindamiseks.

Selles artiklis vaadeldakse süstemaatiliselt geeniteraapiatoodete viiruse kliirensi valideerimise uuringuprotokollide peamisi kavandamise kaalutlusi mitmest vaatenurgast, sealhulgas regulatiivne taust, riski hindamine, indikaatorviiruse valik, -madalama mudeli disain, halvima-juhtumi seisundi seadistus, inaktiveerimise kineetika uuringud, statistiline analüüs ja protsessi erikaalutlused.

II. Ülevaade reguleerivast raamistikust ja nõuetest

ICH Q5A(R2)-Rahvusvaheline Ühtlustamisfond

ICH Q5A(R2) võeti ametlikult vastu 1. novembril 2023 ja see on viiruseohutuse hindamise peamine rahvusvaheline juhenddokument. Võrreldes 1999. aastal avaldatud Q5A(R1) versiooniga on R2 versiooni olulised uuendused järgmised: äsja lisatud peatükk viiruseohutuse hindamise kohta pidevas tootmises (7. peatükk); riskihindamise tugevdatud roll viirustest vabanemise strateegiate alusena; järgmise põlvkonna järjestuse (NGS) kaasamine viiruse tuvastamise kaalutlustesse; ja selgesõnalised nõuded uudsete toodete ja tootmisprotsesside hindamiseks. Q5A(R2) on vastu võtnud reguleerivad asutused, sealhulgas FDA, EMA ja PMDA, pakkudes ühtset tehnilist raamistikku viiruse eemaldamise valideerimiseks kogu maailmas.

NMPA{0}}Hiina reguleeriv süsteem

NMPA viirusohutuse reguleeriv raamistik hõlmab mitut tasandit:

Dokumendi tase	Dokumendi nimi	Väljalaskeaasta
Alusdokument	Veretoodetest viiruste eemaldamise/inaktiveerimise tehnilised juhised	2002
Alusdokument	Bioloogiliste kudede{0}}tuletatud toodete ja eukarüootsete rakkude{1}}ekspresseeritud toodete viiruseohutuse hindamise tehnilise läbivaatamise üldpõhimõtted	2005
Toote-spetsiifiline juhis	Rekombinantse adeno{0}}seotud viiruse (rAAV) vektorite-põhiste in vivo geeniteraapiatoodete farmatseutiliste uuringute ja kliiniliste uuringute rakenduste tehnilised juhised	2023
Toote-spetsiifiline juhis	Rekombinantse adeno{0}}seotud viiruse (rAAV) vektori-põhiste in vivo geeniteraapiatoodete farmatseutilise kvaliteedi üldised tehnilised nõuded müügiloa taotlemiseks	2025
Uuenduslik juhend	Tehnilised juhised viiruse eemaldamise protsesside platvormivalideerimiseks terapeutiliste rekombinantsete valgutoodete kliinilistes uuringutes (katseversioon)^a	2024

a: See suunis on esimene kord, kui Hiina reguleeriv asutus on kehtestanud süstemaatilised tehnilised nõuded viiruse eemaldamise protsesside platvormi valideerimiseks ja see on kooskõlas ICH Q5A(R2) mõttega.

FDA ja EMA{0}}USA ja Euroopa regulatiivsed nõuded

FDA andis 2024. aasta jaanuaris ametlikult välja ICH Q5A(R2)-l põhineva valdkonna juhenddokumendi. Lisaks on Ameerika Ühendriikide farmakopöa (USP) peatükis<1050.1>annab täiendavaid tehnilisi juhiseid viiruse eemaldamise protseduuride kavandamise, hindamise ja iseloomustamise kohta. FDA korraldab iga kahe aasta tagant viiruse eemaldamise sümpoosioni; 2023. aasta sümpoosion käsitles tipptasemel-teemasid, nagu uudsed meetodid, pidev tootmine, uudsed kromatograafiakandjad ja adsorptiivsed filtrid. EMA peamised juhenddokumendid hõlmavad CPMP/BWP/268/95 (Märkus viiruse valideerimise uuringute juhiste kohta: viiruste inaktiveerimist ja eemaldamist kinnitavate uuringute kavandamine, panus ja tõlgendamine) ja EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 Biotechnological Safety Investment on VirusalG Tooted), mis mõlemad on ühtlustatud standardiga ICH Q5A(R2).

III. Riski hindamine-Protokolli kujundamise alus

Viiruslike saasteallikate tuvastamine

ICH Q5A(R2) rõhutab, et viiruse kliirensi valideerimise ülesehitus peaks põhinema kõikehõlmaval riskihinnangul. Geeniteraapia toodete puhul peaks viirussaaste allikate tuvastamine hõlmama järgmisi tasemeid:

Rakupanga tase: endogeensed viirused (nt retroviiruse osakesed) ja latentselt nakkav viirused, mis võivad olla tootmisraku substraatides (nt HEK293, CHO, HeLa). HEK293 rakud sisaldavad teadaolevalt endogeenseid Ad5 E1 järjestusi ja ligikaudu 900 aluspaari pikkust EBV fragmenti ning on võimelised ekspresseerima replikatsioonikompetentset adenoviirust; seetõttu tuleks sellele riskile riskihinnangus erilist tähelepanu pöörata.

Helperviiruse tase: AAV-vektori tootmisel kasutatakse tavaliselt selliseid meetodeid nagu kolmekordne transfektsioon, kasutades abistajaplasmiide, millega kaasneb replikatsiooni{0}}kompetentse adenoviiruse (RCA) tekke oht. Samamoodi võivad lentiviiruse vektori tootmiseks kasutatavad pakendamisrakud tekitada replikatsiooni -kompetentse lentiviiruse (RCL).

Tooraine tase: juhuslikud viirused võivad sattuda tootmises kasutatavate toorainete, sealhulgas rakukultuurisöötmete, söödade ja ensüümide kaudu. See oht on eriti oluline, kui kasutatakse loomse päritoluga komponente (nt veise loote seerumit, trüpsiini seedimise lahuseid).

Riski erinevused: geeniteraapia vs traditsioonilised rekombinantsed valgud

Riski mõõde	Traditsioonilised rekombinantsed valgutooted	Geeniteraapia tooted
Viiruse allikas	Endogeensed viirused rakupangast; juhuslikud viirused	rakupanga viirused; abistaja viirused; replikatsiooni{0}}kompetentsed vektorid (RCV/RCL); peremehe genoomi integreerimine
Raku substraat	CHO, NS0, Sp2/0 ja muud hästi-iseloomulikud rakuliinid	HEK293, HeLa, CHO jne; mõned rakuliinid on tuumorigeenset päritolu
Toote omadused	valgu{0}}põhine ravim; hästi-defineeritud struktuur	Viiruslik vektor; kujutab endast bioohutuse riske
Valideerimisstrateegia	mitmeastmeline viiruse eemaldamine; rõhk protsessietappide valideerimisel	Vajalik RCV/RCL tuvastamine; valideerimine ja testimine on mõlemad olulised
Platvormi valideerimine	Kohaldatav väljakujunenud protsesside puhul, nagu S/D, madal pH, nanofiltratsioon	Piiratud rakendatavus vektortüüpide mitmekesisuse tõttu

Tabel 1. Viiruseohutusriskide võrdlus: geeniteraapiatooted vs. traditsioonilised rekombinantsed valgutooted

IV. Indikaatorviiruse valimise strateegia

Üldpõhimõtted

Indikaatorviiruse valik on viiruse kliirensi valideerimisprotokollide väljatöötamise keskne element. ICH Q5A(R2) nõuab, et indikaatorviiruse valik põhineks riskihinnangul ja võtaks arvesse järgmisi tegureid:

Viiruse tähtsus tootmisraku substraadile (asjakohane viirus)

Viiruse füüsikalis-keemilised omadused (ümbrisega/mitte{0}}ümbrisega, DNA/RNA, suurusvahemik)

Viiruse vastupidavus füüsikalistele/keemilistele töötlustele

Viiruse tuvastatavus ja bioohutus

Geeniteraapia toodete puhul tuleb indikaatorviiruse valikul lisaks arvestada: vektorviiruse enda rolli "asjakohase viirusena"; abistaja viirusega nakatumise võimalik oht; ning replikatsiooni{0}}kompetentsete viiruste (RCV/RCL) tuvastamise ja kinnitamise nõuded.

Soovitatav indikaatorviiruse paneel

Viirus	Tüüp	Ümbrik	Genoom	Suurus (nm)	Valiku põhjendus / rakendus
MVM	Parvoviirus	Mitte ühtegi	ssDNA	18–26	-ümbrikuta mudel; väikseim suurus ja suurim takistus; sobib nanofiltratsiooni valideerimiseks (üldiselt ei kehti rAAV vektortoodete puhul)
PPV	Parvoviirus	Mitte ühtegi	ssDNA	18–26	-ümbrikuta mudel; veretoodete puhul sageli kasutatav indikaatorviirus
Reo-3	Reoviirus	Mitte ühtegi	dsRNA	60–80	-ümbrikuta mudel; keskmise suurusega; kõrge füüsiline stabiilsus
PRV	Herpesviridae	Jah	dsDNA	150–200	Ümbrisega mudel; suur suurus; lai hostivalik
X-MuLV	Retroviirus	Jah	ssRNA	80–110	Ümbrisega retroviiruse mudel; sobib CHO{0}}tuletatud rakusubstraatide jaoks
BVDV	Flaviviridae	Jah	ssRNA	40–60	Ümbrisega mudel; kasutatakse keemiliste inaktiveerimismeetodite (HCV surrogaat) hindamiseks
VSV	Rhabdoviridae	Jah	ssRNA	70	Ümbrisega mudel; lai pH-taluvus; sobib madala{0}}pH inaktiveerimise valideerimiseks

Tabel 2. Soovitatav indikaatorviiruse paneel geeniteraapiatoodete viiruse eemaldamise valideerimiseks

Erikaalutlused AAV Vectori toodete puhul

Rekombinantsete AAV-vektoritoodete puhul nõuavad NMPA tehnilised juhised rAAV-vektori{0}}põhiste in vivo geeniteraapiatoodete farmatseutiliste uuringute ja kliiniliste uuringute rakenduste hindamiseks tähelepanu pöörama pädeva AAV-i (rcAAV) replikatsiooni tuvastamisele. rcAAV viitab AAV-le, mis on võimeline autonoomseks replikatsiooniks, mis tavaliselt tuleneb homoloogsest rekombinatsioonist abistaja plasmiidi ja produkti AAV genoomi vahel. rcAAV tuvastamiseks kasutatakse tavaliselt nakkusteste või qPCR meetodeid, mis viiakse läbi raviaine ja puhastatud produktiga eraldi.

Väärib märkimist, et AAV-vektori toodete allavoolu puhastusprotsessid hõlmavad tavaliselt nukleaasiga lõhustamist, kromatograafiat (AEX), nanofiltratsiooni ja ioonivahetuskromatograafiat (CEX/IEX). Traditsioonilise viiruse kliirensi valideerimise korral võivad need protsessietapid põhjustada AAV vektori enda märkimisväärset kadu; seetõttu tuleb vektori ja indikaatorviiruste vahelist vastasmõju hoolikalt kaaluda-madalama mudeli kavandamisel. Teatud protsessietappidel (nt nanofiltreerimine), kus AAV vektori kaod on olulised, tuleks hinnata, kas protsessi kohandamine on valideerimisandmete põhjal õigustatud (nt nanofiltratsioonimembraani pooride suuruse reguleerimine).

V. Mudeli disaini ja kvalifikatsiooni vähendamine-

Üldpõhimõtted

Vähendatud{0}}mudel (SDM) on viiruse eemaldamise kontrollimise põhitööriist; selle disain peab täpselt kajastama tootmisprotsessi viirusetõrjet. ICH Q5A(R2) jaotis 6.2.2 nõuab sõnaselgelt, et vähendatud-mudel säilitaks põhiparameetrite osas kooskõla tootmisprotsessiga. Geeniteraapia toodete puhul on SDM-i kujundamisel eriti olulised järgmised kaalutlused:

Kriitiliste protsesside parameetrite esindatus

Madalama-mudel peaks olema tootmisprotsessiga kooskõlas järgmiste parameetrite osas: kromatograafilised tingimused (puhvri koostis, pH, juhtivus); laadimissuhe (vektori/supernatandi valgu massisuhe); kokkupuuteaeg ja temperatuur; voolukiirus / viibimisaeg; toote puhtus ja koostis. AAV-toodete puhul tuleks konkreetselt käsitleda ka vektori osakeste suuruse jaotuse ja tühja kapsiidi sisalduse mõju nanofiltratsiooni jõudlusele.

Mudeli kvalifikatsiooninõuded

ICH Q5A(R2) nõuab mastaabis -alla mudeli adekvaatset kvalifitseerimist, sealhulgas: toote kvaliteedi atribuutide (nt puhtus, taastumine, tihedus) võrdlust; kriitiliste protsessiparameetrite järjepidevuse kvalifikatsioon; ja tagades, et vähendatud-mudel kajastab tootmisprotsessi varieeruvust. Kromatograafia etappide puhul tuleks kvalifitseerida piigi profiili, elueerimise ja pesu konsistents; nanofiltratsiooni etappide puhul tuleks kontrollida mahumahu ja toote koostise mõju.

VI. Halvima-juhu tingimuse seadistus

Halvima-juhu tingimuste seadmine on viiruse eemaldamise valideerimisprotokollide kavandamisel kriitiline element. Põhiprintsiip on järgmine: valideerimine peaks toimuma viiruse eemaldamiseks kõige ebasoodsamatel tingimustel, et tootmisprotsessis saavutataks kavandatud viiruse eemaldamise jõudlus kogu normaalses töövahemikus.

Protsessi etapp	Kriitilise protsessi parameetrid	Halvima-juhtumi määramise põhimõtted
S/D inaktiveerimine	Lahusti/pesuaine kontsentratsioon, temperatuur, kokkupuuteaeg	Kasutage madalamaid -seotud kontsentratsioone ja temperatuuri, minimaalset kokkupuuteaega, maksimaalset valgukontsentratsiooni
Madala{0}}pH inaktiveerimine	pH, kokkupuuteaeg, temperatuur, puhversüsteem	Kasutage kõrgeimat lubatud pH-d, minimaalset kokkupuuteaega, madalaima pH puhverdusvõimega puhvrit
Nanofiltratsioon	Filtri tüüp, maht, filtreerimisrõhk	Kasutage maksimaalset määratud mahutavust; kõrgeim/madalaim filtreerimisrõhk (andmed viitavad viiruse läbimurderiskile madala rõhu all); kõrgeima viskoossusega proov
Kromatograafia	Koormusvõime, pH, juhtivus, viibimisaeg	Kasutage maksimaalset laadimisvõimet; pH/juhtivuse kombinatsioon on viiruse eemaldamiseks kõige vähem soodne

Tabel 3. Peamised kaalutlused halvima-juhu tingimuste seadmiseks iga protsessietapi jaoks

NMPA tehnilised juhised viiruse eemaldamise protsesside platvormi valideerimiseks terapeutiliste rekombinantsete valgutoodete kliinilistes katsetes (katse) loetlevad tabelis 1 selgesõnaliselt olulised protsessi parameetrid platvormi valideerimiseks, sealhulgas lahusti/pesuvahendi tüüp ja kontsentratsioon, inkubatsiooniaeg, temperatuur, puhvri tüüp, filtri rõhk/voolukiirus. See annab süstemaatilise tehnilise viite halvima-juhtumi seadistuse jaoks.

VII. Inaktiveerimise kineetika uuringud

Inaktiveerimise kineetika uuringud on oluline vahend inaktiveerimisprotsessi etappide tõhususe hindamiseks. NMPA veretoodetest viiruste eemaldamise/inaktiveerimise tehnilistes juhistes nõutakse selgesõnaliselt, et "tuleks uurida viiruse inaktiveerimise kineetikat, sealhulgas viiruse inaktiveerimise kiirust ja inaktiveerimiskõverat". Inaktiveerimise kineetika uuringutes kasutatakse tavaliselt mitme-aja-punkti proovivõtumeetodit, mille käigus kogutakse proove inaktiveerimisprotsessi erinevatel ajahetkedel, mõõdetakse jääkviiruse tiitreid ja joonistatakse inaktiveerimiskõverad.

Madala-pH inaktiveerimine on üks geeniteraapiatoodete puhul kõige sagedamini kasutatavaid inaktiveerimismeetodeid. Tüüpilised madala -pH inaktiveerimistingimused jäävad vahemikku pH 3,5 kuni 3,8, inkubatsiooniajad varieeruvad 30 kuni 120 minutit. Inaktiveerimise kineetika kõverad näitavad tavaliselt "kiire algfaasi, millele järgneb aeglane lõppfaas", st algne reaktsioonikiirus on kiire ja seejärel aeglustub. Kui viiruse inaktiveerimise kiirus aja jooksul märgatavalt väheneb, võib see viidata sellele, et meetod on ebaefektiivne või et jääk-indikaatorviirusel on tekkinud inaktiveerimismeetodi suhtes resistentsus.

Tüüpilised tingimused S/D inaktiveerimiseks on 0,3% TNBP + 1% Tween 80, inkubeeritud temperatuuril 24 kraadi vähemalt 6 tundi, või 0,3% TNBP + 1% Triton X-100, inkubeeritud temperatuuril 24 kraadi vähemalt 4 tundi. S/D inaktiveerimine on efektiivne ainult ümbrisega viiruste vastu ja ei ole efektiivne ümbriseta viiruste (nt MVM, PPV) vastu. Geeniteraapia toodete eelnevates puhastusprotsessides piirab S/D inaktiveerimise rakendamist selle potentsiaalne mõju vektori aktiivsusele ja seda ei kasutata üldiselt viiruse esmase inaktiveerimismeetodina; selle asemel kasutatakse seda viiruste inaktiveerimiseks teistes protsessi vaheühendites.

VIII. Statistiline analüüs ja LRV arvutamine

LRV arvutusvalem

Log Reduction Value (LRV) on viiruse kliirensi efektiivsuse mõõtmise põhinäitaja. ICH Q5A(R2) jaotises 6.5 on LRV arvutusmeetodite ja statistilise töötluse üksikasjalik kirjeldus. LRV arvutamise põhivalem on järgmine: LRV=log₁₀(N₀/N), kus N0 on esialgne viiruse tiiter pärast viiruse suurenemist ja N on viiruse jääktiiter pärast töötlemist. Kui jääkviiruse tiiter langeb alla testi avastamispiiri, tuleks kasutada selliseid hindamismeetodeid nagu Poissoni jaotus (nt suuremahuline{9}}testimine).

Usaldusintervallide rakendamine

Nii ICH Q5A(R2) kui ka EMA CPMP/BWP/268/95 nõuavad LRV arvutustulemuste usaldusvahemiku hindamist. Tavaliselt rakendatakse 95% usaldusvahemikku.

Tõhususe kriteeriumid

Vastavalt NMPA tehnilistele juhistele viiruste eemaldamiseks/inaktiveerimiseks veretoodetest näitab viiruse vähenemine rohkem kui 4 logi, et protsessi etapp on viiruse eemaldamiseks/inaktiveerimiseks tõhus. See kriteerium ei ole siiski absoluutne lävi ja seda tuleks hinnata terviklikult koos inaktiveerimise kineetika kõverate, indikaatorviiruse valiku teadusliku põhjenduse ja valideerimisprotokolli ülesehituse üldise usaldusväärsusega. Geeniteraapiatoodete puhul tuleks erilist tähelepanu pöörata kumulatiivsele kliirensivõimele kõigi protsessietappide lõikes, et tagada üldine viiruse ohutusprofiil vastuvõetaval tasemel.

IX. Protsessi erilised kaalutlused geeniteraapiatoodete puhul

Nanofiltratsiooni rakendamine ja väljakutsed

Viiruse-retentiivne filtreerimine (nanofiltratsioon) on kriitiline viiruse eemaldamise etapp geeniteraapia toodete järgneval puhastamisel. Tüüpiliste viiruste{2}}retentiivsete filtrite pooride suurus on ligikaudu 20 nm. Nanofiltratsiooni viiruse eemaldamise mehhanism põhineb peamiselt suurusel{5}} põhineval välistamisel ja see võib tõhusalt eemaldada enamiku viirustest, mis on suuremad kui membraani pooride suurus, sealhulgas ümbristamata väikesed parvoviirused, nagu MVM ja PPV.

Geeniteraapiatoodete nanofiltreerimine seisab aga silmitsi ainulaadsete väljakutsetega: AAV vektorite suurus (ligikaudu 20–26 nm) on sarnane teatud indikaatorviiruste omaga (nt MVM, 18–26 nm), mis võib põhjustada vektori taastumise vähenemist; tühjad kapsiidid võivad mõjutada filtreerimisvoogu ja viiruse retentsiooni efektiivsust; proovi viskoossus võib vektori kontsentratsiooniga oluliselt suureneda. Seetõttu peaks nanofiltratsiooni valideerimise SDM-i disain täielikult arvestama vektori osakeste suuruse jaotuse ja tühja kapsiidi sisalduse mõju filtreerimisvõimele ning kaaluda tuleks vajaduse korral suurema poorisuurusega nanofiltratsioonimembraanide kasutamist.

Kromatograafia etappide viiruse kliirensi hindamine

Ioonivahetuskromatograafia (IEX) on AAV-produktide puhastusprotsesside põhietapp, milles tavaliselt kasutatakse nukleaasiga lõhustamist, millele järgneb anioonvahetuskromatograafia (AEX), et püüda kinni tühjad ja defektsed kapsiidid, või katioonvahetuskromatograafia (CEX) täiskapsiidide peenpuhastamiseks. Viiruse eemaldamise mehhanismid kromatograafia etappides hõlmavad suuruse välistamist, elektrostaatilisi interaktsioone, afiinsusinteraktsioone ja muid tegureid. FDA 2023. aasta viiruse eemaldamise sümpoosionil toimunud aruteludel rõhutati, et kromatograafia etappide viiruse eemaldamise efektiivsust mõjutavad mitmed tegurid, sealhulgas laadimisvõime, pH, juhtivus ja vaigu tsükkel; igakülgseks hindamiseks tuleks kasutusele võtta mitme teguriga ortogonaalse disaini lähenemisviis.

Viiruseohutuskontroll pidevas tootmises

Hiljuti lisatud ICH Q5A(R2) 7. peatükis on sätestatud spetsiifilised nõuded viirusohutuse hindamisele pidevas tootmises. Geeniteraapiatoodete puhul on pidev tootmine muutunud oluliseks arengusuunaks, kuid see toob kaasa ka uusi viirusohutuse väljakutseid. Pidevas tootmises kasutatavad viirusohutuskontrolli strateegiad hõlmavad järgmist: kriitiliste tõkestamismeetmetena on-liinisisesed viirusetõkkefiltrid; viibimisaegade ja protsessivoogude sobiv kavandamine; määratletud ooteaegadega inaktiveerimisetappide kaasamine; ja protsessianalüütilise tehnoloogia (PAT) täiustatud rakendamine kriitiliste protsessiparameetrite{6}}reaalajas jälgimiseks.

X. Järeldused ja väljavaade

Geeniteraapiatoodete viirustest vabanemise valideerimisprotokollide kavandamine nõuab ICH Q5A(R2) raames individuaalseid lähenemisviise, mis on kohandatud toote spetsiifilistele omadustele ja regulatiivsetele nõuetele. Võrreldes traditsiooniliste rekombinantsete valgutoodetega, nõuab geeniteraapiatoodete viirusohutuse hindamine erilist tähelepanu lisariskidele, mis tulenevad vektori {{4}spetsiifilistest omadustest (RCV/RCL), vektorite ja indikaatorviiruste vastastikmõjudest ning uudsete puhastusprotsesside mõjust viiruse kliirensile.

Tulevikku vaadates väärivad tähelepanu mitmed suunad: platvormi valideerimise laiendatud rakendamine, eelkõige NMPA välja antud platvormi valideerimise juhistega ette nähtud selge tehniline tee; järgmise{0}}generatsiooni järjestuse (NGS) rakendamine viiruse tuvastamisel, mis suurendab viiruse tuvastamise ulatust ja tundlikkust; viiruse ohutuse kontrollistrateegiate pidev täiustamine pidevas tootmises protsessi arendamise edenedes; ning uudsete kromatograafiakeskkondade ja adsorptiivsete filtrite viiruse eemaldamise jõudlus, mis pakuvad geeniteraapiatoodetele täiendavaid tehnilisi võimalusi.

Viited

ICH Q5A(R2). Inim- või loomse päritoluga rakuliinidest saadud biotehnoloogiatoodete viirusohutuse hindamine. Vastu võetud 21. novembril 2023.
NMPA. Rekombinantse adeno{1}}seotud viiruse (rAAV) vektori-in vivo geeniteraapiatoodete farmatseutiliste uuringute ja kliiniliste uuringute rakenduste hindamise tehnilised juhised. 2023.
NMPA. Üldised tehnilised nõuded rekombinantse adeno{1}}seotud viiruse (rAAV) vektorite-in vivo geeniteraapiatoodetele müügiloa taotlemiseks. 2025.
NMPA. Tehnilised juhised viiruse eemaldamise protsesside platvormivalideerimiseks terapeutiliste rekombinantsete valgutoodete kliinilistes katsetes (katseversioon). veebruar 2024.
NMPA. Veretoodetest viiruste eemaldamise/inaktiveerimise tehnilised juhised. Guoyao Jian Zhu [2002] Ei. 160. 2002.
NMPA. Bioloogilise koe viiruseohutuse hindamise tehnilise läbivaatamise üldpõhimõtted-Tuletatud tooted ja eukarüootsed rakud-ekspresseeritud tooted. 2005.
EMA. CPMP/BWP/268/95. Viiruste kontrollimise uuringute juhend: Viiruste inaktiveerimist ja eemaldamist kinnitavate uuringute kavandamine, panus ja tõlgendamine. Vastu võetud 14. veebruaril 1996. aastal.
EMA. EMEA/CHMP/BWP/398498/2005. Biotehnoloogiliste uurimisravimite viirusohutuse hindamise juhend. juuli 2008.
WHO. Viiruse inaktiveerimise ja eemaldamise protseduuride juhised, mis on mõeldud inimvereplasmatoodete viirusohutuse tagamiseks. WHO TRS 924, lisa 4. 2004.
Roush D, Bolton G. 2023. aasta viiruse eemaldamise sümpoosioni toimetised. PDA J Pharm Sci Technol, 2024, 78(2): 131–155.
USP.<1050.1>Viiruse eemaldamise protseduuride kavandamine, hindamine ja iseloomustus.
NMPA. Geeniteraapiatoodete kvaliteedikontrolli uuringute peamised kaalutlused. 2023.